ФС.2.1.0470. Метотрексат

утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377

Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.

Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Метотрексат	ФС.2.1.0470
Метотрексат
Methotrexatum	Взамен ФС 42-1592-88

 

C20H22N8O5	М.м. 454,4
[59-05-2]

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

(2S)-2-(4-{[(2,4-Диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)пентандиовая кислота.

Cодержит не менее 97,0 % и не более 102,0 % метотрексата C₂₀H₂₂N₈O₅ в пересчёте на безводное и свободное от остаточных растворителей вещество.

СВОЙСТВА

Описание. Жёлтый или оранжевый кристаллический порошок.

*Гигроскопичен.

Растворимость. Практически нерастворим в воде, спирте 96 %, метиленхлориде.

*Растворяется в разбавленных растворах минеральных кислот, щелочей и карбонатах.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. ИК-спектрометрия (ОФС «Спектрометрия в средней инфракрасной области»). Инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом, в области от 4000 до 400 см–1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру фармакопейного стандартного образца метотрексата.

2. ВЭЖХ. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пика метотрексата на хроматограмме раствора стандартного образца метотрексата (раздел «Количественное определение»).

ИСПЫТАНИЯ

Удельное вращение. От +19 до +24 в пересчёте на безводное вещество (1 % раствор субстанции в натрия карбоната растворе 0,05 М, ОФС «Оптическое вращение»).

Прозрачность раствора. Раствор 50 мг субстанции в 10 мл натрия карбоната растворе 0,05 М должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»).

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

1. Энантиомерная чистота

Буферный раствор. Смешивают 600 мл натрия дигидрофосфата раствора 0,05 М с 500 мл динатрия гидрофосфата раствора 0,05 М и доводят значение pH раствора натрия гидроксида раствором 8,5 % до 6,9.

Подвижная фаза (ПФ). Пропанол—буферный раствор 80:920.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 20 мг субстанции, растворяют в ПФ и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

Раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объём раствора ПФ до метки.

Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 4 мг фармакопейного стандартного образца метотрексата, для проверки пригодности хроматографической системы, содержащего примесь F, растворяют в ПФ и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

Примечание

Примесь F: (2R)-2-(4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)пентандиовая кислота [51865-79-3].

Хроматографические условия

Колонка	150 × 3,9 мм, силикагель модифицированный альбумином для хиральной хроматографии, 7 мкм, размер пор 30 нм;
Температура колонки	25 °С;
Скорость потока	1,5 мл/мин;
Детектор	спектрофотометрический, 302 нм;
Объём пробы	20 мкл;
Время хроматографирования	3-кратное от времени удерживания пика метотрексата.

Хроматографируют раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы, раствор сравнения и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Метотрексат – 1 (около 7,5 мин); примесь F – около 2,3.

Идентификация примесей. Для идентификации пика примеси F используют относительное время удерживания соединения и хроматограмму раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы разрешение (R_S) между пиками метотрексата и примеси F должно быть не менее 2,0. Для достижения требуемого разрешения содержание пропанола в ПФ может быть уменьшено на 6–8 %.

Допустимое содержание примеси. На хроматограмме испытуемого раствора:

— площадь пика примеси F не должна более чем в 3 раза превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 3,0 %).

2. Другие примеси

Буферный раствор. Растворяют 3,4 г натрия дигидрофосфата в 900 мл воды и доводят значение рН раствора натрия гидроксида раствором 1 М до 6,0, количественно переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят объём раствора водой до метки.

Подвижная фаза А (ПФА). Ацетонитрил—буферный раствор 50:950.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Ацетонитрил—буферный раствор 500:500.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 40 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака раствора 10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки.

Раствор сравнения А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 5,0 мл испытуемого раствора и доводят объём раствора ПФА до метки. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора ПФА до метки.

Раствор сравнения Б. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5,0 мл раствора сравнения А и доводят объём раствора ПФА до метки.

Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 5 мг субстанции, 5 мг примеси B, 5 мг фармакопейного стандартного образца примеси C, 5 мг фармакопейного стандартного образца примеси D и 5 мг фармакопейного стандартного образца примеси E, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака раствора 10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 3,0 мл раствора сравнения Б и доводят объём раствора ПФА до метки.

Раствор для идентификации. Растворяют 8 мг фармакопейного стандартного образца метотрексата для идентификации пиков, содержащего примеси H и I, в смеси 0,1 мл аммиака раствора 10 % и 1 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки.

Примечание

Примесь В: (2S)-2-(4-{[(2,4-Диаминоптеридин-6-ил)метил]амино}бензамидо)пентандиовая кислота [54-62-6].

Примесь C: (2S)-2-(4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)пентандиовая кислота [2410-93-7].

Примесь D: 4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензойная кислота [5623-18-7].

Примесь E: 4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензойная кислота [19741-14-1].

Примесь H: (2S)-2-(4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)-5-метокси-5-оксопентановая кислота [67022-39-3].

Примесь I: (4S)-4-(4-{[(2,4-диаминоптеридин-6-ил)метил](метил)амино}бензамидо)-5-метокси-5-оксопентановая кислота [66147-29-3].

Хроматографические условия

Колонка	250 × 4,0 мм, силикагель октадецилсилильный, эндкепированный для хроматографии, 5 мкм;
Температура колонки	25 °С;
Скорость потока	1,5 мл/мин;
Детектор	спектрофотометрический, 280 нм;
Объём пробы	20 мкл.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0–10	100	0
10–20	100 → 95	0 → 5
20–28	95 → 50	5 → 50
28–37	50	50

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы, раствор для идентификации, раствор сравнения Б, раствор сравнения А и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Метотрексат – 1 (около 18 мин); примесь B – около 0,3; примесь C – около 0,4; примесь D – около 0,9; примесь E – около 1,4; примесь I – около 1,5; примесь H – около 1,6.

Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей В, С, D и Е используют относительное время удерживания соединений и хроматограмму раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. Для идентификации пиков примесей  I и H используют относительное время удерживания соединений и хроматограмму раствор для идентификации.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы отношение сигнал/шум (S/N) для пика метотрексата должно быть не менее 10.

На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы:

— разрешение (R_S) между пиками примесей B и C должно быть не менее 2,0;

— разрешение (R_S) между пиками примеси D и метотрексата должно быть не менее 1,5.

На хроматограмме раствора для идентификации разрешение (R_S) между пиками примесей I и H должно быть не менее 1,5.

Если разрешение между пиками примеси D и метотрексата менее требуемого, следует увеличить скорость потока.

Поправочные коэффициенты. Для расчёта содержания площади пиков следующих примесей умножают на соответствующие поправочные коэффициенты: примесь E – 0,8; примесь I – 1,4.

Допустимое содержание примесей. На хроматограмме испытуемого раствора:

— площадь пика примеси C не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения А (не более 0,5 %);

— площадь пика каждой из примесей B и E не должна превышать 0,6 площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения А (не более 0,3 %);

— площадь пика каждой из примесей H и I не должна превышать более чем в 2 раза площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения Б (не более 0,2 %);

— площадь пика любой другой примеси не должна превышать 0,5 площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения Б (не более 0,05 %);

— сумма площадей пиков всех примесей, за исключением примесей B, C и E, не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения А (не более 0,5 %).

Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы (менее 0,03 %).

Вода. Не более 13,0 % (ОФС «Определение воды», метод 1). Для определения используют 0,1 г (точная навеска) субстанции.

Сульфатная зола. Не более 0,1 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Тяжёлые металлы. Не более 0,001 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 3Б) в зольном остатке, полученном после сжигания 1,0 г субстанции, с использованием эталонного раствора 1.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».

Бактериальные эндотоксины. Не более 0,2 ЕЭ на 1 мг метотрексата (ОФС «Бактериальные эндотоксины»). Для проведения испытания готовят исходный раствор субстанции с концентрацией метотрексата 10 мг/мл в натрия гидроксида раствора 0,1 М.

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Определение проводят методом ВЭЖХ в условиях испытания «Родственные примеси. Другие примеси» со следующими изменениями.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 25 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака раствора 10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора ПФА до метки.

Раствор стандартного образца метотрексата. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 25 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца метотрексата, растворяют в смеси 0,5 мл аммиака раствора 10 % и 5 мл ПФА, и доводят объём раствора ПФА до метки. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора ПФА до метки.

Хроматографируют раствор стандартного образца метотрексата и испытуемый раствор.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора стандартного образца метотрексата фактор асимметрии пика (A_S) метотрексата должен быть не более 1,5;

Содержание метотрексата C₂₀H₂₂N₈O₅ в субстанции в пересчёте на сухое вещество  в процентах (X) вычисляют по формуле:

где	S1	–	площадь пика метотрексата на хроматограмме испытуемого раствора;
	S0	–	площадь пика метотрексата на хроматограмме раствора стандартного образца метотрексата;
	а1	–	навеска субстанции, мг;
	а0	–	навеска фармакопейного стандартного образца метотрексата, мг;
	W	–	суммарное содержание воды и остаточных органических растворителей в субстанции, %;
	P	–	содержание метотрексата в фармакопейного стандартном образце метотрексата, %.

ХРАНЕНИЕ

В плотно закрытой упаковке в защищённом от света месте.

 

*Приводится для информации.