ОФС.1.2.2.2.0031. Примеси N-нитрозаминов

утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377

Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.

Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Примеси N-нитрозаминов	м
	Вводится впервые

Методики определения примесей N-нитрозаминов в фармацевтических субстанциях синтетического происхождения группы сартана основаны на использовании масс-спектрометрии.

N-нитрозамины – это класс органических веществ, молекулы которых содержат алкилнитрозаминогруппу:

Соединения N-нитрозаминов классифицируются как вероятные канцерогены для человека. В силу потенциальной токсичности этих примесей рекомендуется применять меры по контролю и ограничению их присутствия в фармацевтических субстанциях.

Целесообразность определения примесей N-нитрозаминов в лекарственных препаратах устанавливается на этапе фармацевтической разработки.

Особое значение имеют соединения, приведенные в таблице 1.

Химическое название	Структурная формула	Брутто-формула	Молекулярная масса
N-нитрозо-диметиламин		C2H6N2O	74,082
N-нитрозо-диэтиламин		C4H10N2O	102,135
N-нитрозо-дибутиламин		C8H18N2O	158,241
N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановая кислота		C5H10N2O3	143,145
N-нитрозо-диизопропиламин		C6H14N2O	130,188
N-нитрозо-этил-изопропиламин		C5H12N2O	116,162
N-нитрозо-дипропиламин		C6H14N2O	130,188
N-нитрозо-метил-фениламин		C7H8N2O	136,151

Нормы содержания примесей N-нитрозаминов должны быть приведены в фармакопейной статье. В случае их отсутствия нормы содержания должны быть рассчитаны с использованием значений максимально допустимой суточной дозы примесей указанных веществ (табл. 2).

Таблица 2 – Максимально допустимая суточная доза примесей
N-нитрозаминов

Наименование примеси	Допустимая суточная доза, нг/сут
N-нитрозо-диметиламин (НДМА)	не более 96,0
N-нитрозо-диэтиламин (НДЭА)	не более 26,5
N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановая кислота (НМАК)	не более 96,0
N-нитрозо-диизопропиламин (НДИПА)	не более 26,5
N-нитрозо-этил-изопропиламин (НЭИПА)	не более 26,5

К наиболее вероятным причинам образования примесей
N-нитрозаминов в лекарственных средствах относятся:

— использование натрия нитрита или других нитрозирующих соединений в синтезе фармацевтической субстанции.

Например:

— использование загрязнённых сырьевых материалов (растворителей, реагентов и катализаторов) в синтезе фармацевтической субстанции;

— регенерация растворителей, реагентов и катализаторов в процессе синтеза;

— использование контаминированных исходных материалов;

— контаминация от перекрёстно протекающих процессов синтеза;

— деградация исходных материалов, промежуточных продуктов или лекарственных веществ, в том числе при хранении;

— использование определенных видов упаковки (например, возможна контаминация лекарственного препарата в его первичной упаковке; в контурной ячейковой упаковке (блистере), так как покрывающая фольга, содержащая нитроцеллюлозный праймер, способна реагировать с аминами в чернилах с образованием нитрозаминов, которые могут быть перенесены в препарат при определенных условиях упаковки).

Определение N-нитрозаминов проводят приведёнными ниже методиками или иными методиками, указанными в фармакопейной статье.

Методика 1

Методика распространяется на определение семи примесей
N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане и лозартане калия: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА),
N-нитрозо-дибутиламина (НДБА), N-нитрозо-метил-фениламина (НМФА) и N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановой кислоты (НМАК).

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»).

Подвижная фаза А (ПФА). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 10 мл муравьиной кислоты безводной, прибавляют 500 мл воды и доводят объём раствора водой до метки.

Подвижная фаза Б (ПФБ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 10 мл муравьиной кислоты безводной, прибавляют 500 мл метанола и доводят объём раствора метанолом до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 5 мл помещают 0,1 г (точная навеска) субстанции, прибавляют 4 мл метанола, интенсивно перемешивают до растворения, доводят объём раствора метанолом до метки и фильтруют через шприцевой мембранный фильтр из поливинилиденфторида с размером пор 0,22 мкм, отбрасывая первый 1 мл фильтрата.

Стандартный раствор примесей N-нитрозамина. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА и НМФА в метаноле с концентрацией по 6 нг/мл.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, НМФА в метаноле с концентрацией по 1 нг/мл.

Хроматографические условия

Колонка		100 × 4,6 мм, силикагель пентафторфенилпропильный, эндкепированный, для хроматографии, 2,6 мкм;
Температура колонки		40 °С;
Температура образца		4 °С;
Скорость потока		0,6 мл/мин;
Объём пробы		3 мкл.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0–1,5	90	10
1,5–7,0	90 → 45	10 → 55
7,0–17,0	45	55
17,0–17,1	45 → 10	55 → 90
17,1–21,0	10	90
21,0–21,1	10 → 90	90 → 10
21,1–25,0	90	10

Условия детектирования

Источник ионизации

электронная ионизация.

 

Примесь	НДМА	НМАК	НДЭА	НЭИПА	НДИПА	НМФА	НДБА
Режим сканирования	SIM	SIM	PRM	SIM	SIM	SIM	PRM
Полярность	+	–	+	+	+	+	+
Начало-окончание сканирования, мин	1,0–3,5	3,5–5,5	5,5–7,0	7,0–8,5	8,5–10	8,5–10	13,0–15,5
Величина m/z (PRM)	–	–	103,0866	–	–	–	159,1492
Нормализованная энергия столкновения	–	–	25	–	–	–	20
Диапазон сканирования	m/z 74,3– 75,8	m/z 144,3–145,8	m/z 50,0– 114,0	m/z 116,4– 117,9	m/z 130,4–131,9	m/z 136,3– 137,8	m/z 50,0– 170,0
Микросканирования	3	3	3	3	3	3	3
Разрешение	30000	60000	30000	60000	60000	60000	60000
Автоматический контроль усиления (%)	250	250	250	250	250	250	250

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, стандартный раствор и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений: НДБА – 1,0 (около, 14,2 мин); НДМА – около 0,20; НМАК – около 0,31, НДЭА – около 0,46; НЭИПА – около 0,57; НДИПА – около 0,66; НМФА – около 0,67.

Пригодность ВЭЖХ-МС системы

На хроматограмме стандартного раствора относительное стандартное отклонение площади каждого из пиков примесей
N-нитрозаминов должно быть не более 20,0 % (6 введений).

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей N-нитрозаминов должно быть не менее 10.

Обработка результатов

Для количественного определения используются площади пиков целевых ионов с допуском m/z 15 ppm. Ниже перечислены целевые значения m/z:

Примесь	НДМА	НМАК	НДЭА	НЭИПА	НДИПА	НМФА	НДБА
Целевое значение m/z	75,0553	145,0619	75,0553, 103,0866	117,1022	131,1179	137,0709	57,0704, 103,0872, 159,1492

Примечание – Примеси НМАК и НЭИПА существуют как синконформационный и антиконформационный изомеры из-за ограниченного вращения связи N–N. Эти изомеры в условиях метода разделяются частично. Пик НМАК наблюдается как дублет, для расчёта концентрации НМАК интегрируют оба пика и используют суммарную площадь. Пик НЭИПА может быть как дублетом, так и одиночным пиком с хвостовым плечом. Если конформеры разделяются, для расчёта концентрации НЭИПА интегрируют оба пика и суммируют их площади, если же конформеры разделены не полностью (наблюдается полупик), для расчёта концентрации НЭИПА интегрируют основной пик и полупик как единый.

Содержание каждой из примесей N-нитрозаминов в субстанции в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где	S1	–	площадь пика каждой из примесей N-нитрозаминов на хроматограмме испытуемого раствора;
	S0	–	площадь пика соответствующей примеси N-нитрозаминов на хроматограмме стандартного раствора;
	С1	–	концентрация субстанции в испытуемом рвстворе, нг/мл;
	С0	–	концентрация каждой из примеси НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА и НМФА в стандартном растворе, нг/мл;
	P	–	содержание основного вещества в стандартном образце соответствующей примеси, %.

Методика 2

Методика распространяется на определение четырёх примесей
N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане, лозартане калия, олмесартане медоксомиле, кандесартане цилексетиле и телмисартане:
N-нитрозодиметиламина (НДМА), N-нитрозодиэтиламина (НДЭА), нитрозоэтилизопропиламина (НЭИПА) и N-нитрозодиизопропиламина (НДИПА).

Определение проводят методом ГХ (парофазный анализ, ОФС «Газовая хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»).

Раствор внутреннего стандарта А. Готовят раствор N-нитрозо-диметиламина-d₆ в метаноле с концентрацией 0,4 мкг/мл.

Раствор внутреннего стандарта Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объём раствора метанолом до метки.

Испытуемый раствор. В хроматографический флакон для парофазного анализа помещают 0,2 г (точная навеска) субстанции, 0,1 г имидазола, 1,0 мл раствора внутреннего стандарта Б и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Стандартный раствор А. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДИПА и НЭИП в метаноле с концентрацией по 0,4 мкг/мл.

Стандартный раствор Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл стандартного раствора А и 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объём раствора метанолом до метки.

Стандартный раствор В. Помещают 1,0 мл стандартного раствора Б во флакон для парофазного анализа, содержащий 0,1 г имидазола и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы А. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,5 мл стандартного раствора А и 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объём раствора метанолом до метки.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы Б. Во флакон для парофазного анализа, содержащий 0,1 г имидазола и 1,0 мл ацетонитрила, помещают 1,0 мл раствора для проверки чувствительности хроматографической системы А. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Контрольный раствор. В хроматографический флакон помещают около 0,1 г (точная навеска) имидазола, прибавляют 1,0 мл раствора внутреннего стандарта Б и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Хроматографические условия

Колонка	кварцевая капиллярная 30 м × 0,32 мм, покрытая слоем макрогола 20 000, 1,0 мкм;
Детектор	масс-спектрометрический;
Газ-носитель	гелий для хроматографии;
Деление потока	1:1 или 1:3;
Скорость потока	1,8 мл/мин;
Температура	колонка	0–3 мин	45 °С
		3–10 мин	45 → 130 °С
		10 мин	190 → 240 °С

Условия парофазного анализа

Температура уравновешивания	95–110  °С;
Время уравновешивания	10 мин;
Температура петли	150 °С;
Температура линии переноса	160 °С.

Условия детектирования

Источник ионизации		электронная ионизация (EI);
Режим детектирования		мониторинг реакций заданных ионов (MRM).

Переходы сканирования масс и энергии столкновений

Наименование примеси	Относительное время удерживания	Переходы сканирования масс	Энергия столкновений, эВ
НДМА	около 0,8	74  44 74  42	4 15
НДМА-d6	около 0,8	80  50	5
НДЭА	около 0,9	102  85,1 102 56,1	6 15
НЭИПА	около 0,96	116  99,1 99  44,1	6 9
НДИПА	1 (около 14 мин)	130  42 130  43,1	10 18

Хроматографируют контрольный раствор, стандартный раствор В, раствор для проверки чувствительности хроматографической системы Б и испытуемый раствор.

Пригодность ГХ-МС системы

На хроматограмме стандартного раствора В относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА НЭИПА и НДИПА к площади пика НДМА-d₆ должно быть не более 20 % (6 введений).

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА НЭИПА и НДИПА должно быть не менее 10.

Содержание каждой из примесей N-нитрозаминов в субстанции в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где	B1	–	отношение площади пика каждой из примесей N-нитрозаминов к площади пика N-нитрозодиметиламина-d6 на хроматограмме испытуемого раствора;
	B0	–	отношение площади пика каждой из примесей N-нитрозаминов к площади пика N-нитрозодиметиламина-d6 на хроматограмме стандартного раствора В;
	С1	–	концентрация субстанции в испытуемом рвстворе, нг/мл;
	С0	–	концентрация каждой из примеси НДМА, НДЭА, НДИПА и НЭИП в стандартном растворе В, нг/мл;
	P	–	содержание основного вещества в соответствующем образце примеси, %.

Методика 3

Методика распространяется на определение пяти примесей
N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане и лозартане калия, кандесартане цилексетиле и олмесартане медоксомиле: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА) и N-нитро-N-метил-4-аминобутановой кислоты (НМАК).

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»)

Подвижная фаза А (ПФА). Муравьиной кислоты раствор 0,1 %.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Метанол.

Раствор внутреннего стандарта. Готовят раствор НДЭА-d₁₀ в метаноле с концентрацией 9,0 нг/мл.

Испытуемый раствор. Суспендируют 0,150 г (точная навеска) субстанции в 0,5 мл метанола, прибавляют 0,5 мл раствора внутреннего стандарта, тщательно перемешивают, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Стандартный раствор примесей N-нитрозаминов. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА и НЭИПА в метаноле с концентрацией по 500 мкг/мл. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объём раствора метанолом до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объём раствора метанолом до метки.

Стандартный раствор А. Суспендируют около 0,15 г (точная навеска) субстанции в 0,5 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, прибавляют 0,5 мл раствора внутреннего стандарта и тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Стандартный раствор Б. Смешивают 0,5 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов и 0,5 мл раствора внутреннего стандарта, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Хроматографические условия

Колонка		150 × 4,6 мм, силикагель октадецилсилильный, эндкепированный для хроматографии, 3,0 мкм;
Температура колонки		40 °С;
Температура образца		5 °С;
Скорость потока		0,5 мл/мин;
Объём пробы		20 мкл.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0–1,0	80	20
1,0–6,0	80 → 55	20 → 45
6,0–14,0	55	45
14,0–16,0	55 → 5	45 → 95
16,0–35,0	5	95

Детектирование: трёхквадрупольный масс-спектрометр в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Следующие настройки были признаны подходящими и приведены в качестве примера; настройки могут быть скорректированы таким образом, чтобы выполнялись требования пригодности системы.

Условия МС/МС

Режим ионизации		APCI-положительный;
Температура нагревателя		350 °C;
Давление в распылителе		310 кПа;
Температура газа:		300 °C;
Расход осушающего газа		5 л/мин;
Ток в короне		6 мкА;
Время выдержки		200 мс;
Напряжение в капилляре (Vкап):		1,5 кВ;
Напряжение ускорения ячейки:		3 В.

Параметры режима MRM

Наименование примеси	Относительное время удерживания	Переходы MRM (m/z)	Энергия столкновений, В	Напряжение фрагментора, В
НДМА	около 0,6	74  58 (75  43)	11 15	20 15
НМАК	около 0,7	147  117 (147  87)	2 6	41 46
НДЭА	около 1	103  75 (103  47)	9 17	25 20
НЭИПА	около 1,3	117  75 (117  47)	7 15	54 59
НДИПА	около 1,6	131  89 (131  47)	2 10	20 25
НДЭА-d10	1 (около 8,6 мин)	113  81 (117  75)	6 14	76 81

Хроматографируют стандартный раствор Б, стандартный раствор А, испытуемый раствор.

Пригодность хроматографический системы

На хроматограмме стандартного раствора Б относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА и НЭИПА к площади пика НДЭА-d₁₀ должно быть не более 20 % (6 введений).

На хроматограмме стандартного раствора А:

— отношение сигнал/шум (S/N) для пика НДМА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 5;

— отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДЭА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;

— отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, соответствующего переходу классификатора, должно быть не менее 3.

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси
N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (B₁).

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси
N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме стандартного раствора А (B₀).

Для каждой обнаруженной примеси N-нитрозамина отношение В₁/В₀ должно быть менее 0,50.

Испытание действительно, если соотношение между площадью пика, соответствующего основному переходу, и площадью пика, соответствующего переходу квалификатора, для испытуемого раствора отличается не более чем на 20 % от того же соотношения, рассчитанного для стандартного раствора А.

Методика 4

Методика распространяется на определение шести примесей
N-нитрозаминов: N-нитрозодиметиламина (НДМА), N-нитрозодиэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА), N-нитрозо-дибутиламина (НДБА) и N-нитрозо-дипропиламина (НДПА).

Определение проводят методом ГХ (ОФС «Газовая хроматография»). С использование масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»)

Раствор внутреннего стандарта. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 5 мг (точная навеска) НЭМА (N-нитрозо-этилметиламина, 10595-95-6), растворяют в метаноле и доводят объём раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 мл полученного раствора и доводят объём раствора водой до метки.

Раствор для экстракции. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 40,0 мг натрия гидроксида, растворяют в 500 мл воды, прибавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта и 50 мл ацетонитрила и доводят объём раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,25 г (точная навеска) субстанции, суспендируют в растворе для экстракции и доводят объём раствора тем же растворителем до метки, встряхивают в течение 5 мин, экстрагируют 2 мл метиленхлорида, встряхивая в течение 5 мин и центрифугируя в течение 5 мин при10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор примесей N-нитрозаминов. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА в метаноле с концентрацией по 500 мкг/мл. В мерную колбу 10 мл помещают 100 мкл полученного раствора и доводят объём раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объём раствора водой до метки.

Испытуемый раствор с добавками. Суспендируют 0,25 г субстанции в 10 мл раствора для экстракции, прибавляют 0,1 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют с помощью 2 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор А. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 50 мкл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор Б. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 100 мкл стандартный раствор примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор В. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 200 мкл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Хроматографические условия

Колонка	кварцевая капиллярная 30 м × 0,25 мм, покрытая слоем поли(цианопропилфенил)(6)(метил)(94)силоксана, 1,4 мкм;
Детектор	масс-спектрометрический;
Газ-носитель	гелий для хроматографии;
Скорость потока	1,3 мл/мин;
Объём пробы	3 мкл;
Температура	колонка	0–0,5 мин	40 °С
		0,5–2,2 мин	40 → 140 °С
		2,2–4,2 мин	140 °С
		4,2–6,2 мин	140 → 180 °С
		6,2–6,7 мин	180 °С
		6,7–8,7 мин	180 → 240 °С
		8,7–10,5	240 °С
		10,5–11,5	240 → 280 °С
		11,5–14,0	280 °С
	Инжектор		250 °С
	Линия переноса		240

Условия детектирования

Источник ионизации		электронная ионизация;
Режим детектирования		мониторинг реакций заданных ионов (MRM);
Температура источников ионов		230 °С;
Температура квадруполя		150 °С;
Энергия электронов		40 эВ;
Задержка растворителя		4,5 мин;
Коэффициент усиления		15
Газ для соударений		азот;
Скорость потока газа для соударений		1,5 мл/мин;
Газ для охлаждения		гелий.

Переходы сканирования масс и энергии столкновений

Компонент	Относительное время удерживания	Переходы сканирования масс	Энергия столкновений, эВ
НДМА	около 0,9	74  44 (74  42)	5 22
НЭМА	1 (около 5,50 мин)	88  71	5
НДЭА	около 1,1	102  85 (102  56)	3 19
НЭИПА	около 1,3	116  99 (116  44)	5 14
НДИПА	около 1,4	130  88 (130  71)	5 14
НДПА	около 1,5	130  113 130  88	1 1
НДБА	около 1,8	158  141 158  99	1 7

Хроматографируют стандартный раствор А, стандартный раствор Б, стандартный раствор В и испытуемый раствор.

Пригодность ГХ-МС системы

Пригодность хроматографический системы

На хроматограмме стандартного раствора Б относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА к площади пика внутреннего стандарта должно быть не более 20 % (6 введений).

На хроматограмме испытуемого раствора с добавками:

— отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;

— отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА, соответствующего переходу квалификатора, должно быть не менее 3.

Для расчёта содержания используют основные MRM-переходы.

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси
N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (B₁).

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси
N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограммеиспытуемого раствора с добавками (B₀).

Для каждой обнаруженной примеси N-нитрозамина отношение В₁/В₀ должно быть менее 0,50.

Испытание действительно, если соотношение между площадью пика, соответствующего основному переходу, и площадью пика, соответствующего квалификационному переходу, для испытуемого раствора отличается не более чем на 20 % от того же соотношения, рассчитанного для раствора с добавками.

Для расчёта содержания используют основные MRM-переходы.

Количественное определение примесей

Хроматографируют по 3 мкл раствора с добавками, испытуемого раствора и стандартных растворов А, Б и В.

Пригодность хроматографической системы

Для каждого N-нитрозамина:

— относительное стандартное отклонение отношения площади пика каждого нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме стандартного раствора Б не должно превышать 20 %
(6 введений);

— отношение сигнал/шум (S/N) для пика, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;

— отношение сигнал/шум (S/N) для пика, соответствующего переходу квалификатора, должно быть не менее 3.

Расчёт: используют основные MRM-переходы.

Строят калибровочную кривую зависимости отношения площади пика каждого N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта в зависимости от концентрации N-нитрозамина на хроматограммах стандартных растворов А, Б и В. По полученной калибровочной кривой определяют концентрацию N-нитрозамина в испытуемом растворе.

Пригодность системы:

— отношение площади пика, соответствующего основному переходу, к площади пика, соответствующего переходу квалификатора, для испытуемого раствора не должно отличаться от того же отношения для раствора с добавками более чем на 20 %;

— рассчитанное извлечение для всех растворов с добавками должно составлять от 70 до 130 %.