ОФС.1.2.3.0019. Определение сахаров спектрофотометрическим методом

утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377

Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.

Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение сахаров спектрофотометрическим методом	ОФС.1.2.3.0019
	Взамен ОФС.1.2.3.0019.15

Методы определения сахаров спектрофотометрическим методом основаны на измерении оптической плотности окрашенных растворов, образуемых при взаимодействии сахаров с антроновым реактивом (метод 1), орциновым реактивом (метод 2) и пикриновой кислотой (метод 3).

Метод 1

Метод основан на реакции гидролиза сложных углеводов до моносахаров в сильнокислой среде с их последующей дегидратацией. Образующийся гидроксиметилфурфурол вступает в реакцию комплексообразования с антроном, в результате наблюдается появление синевато-зелёного окрашивания. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию моносахаров в испытуемом растворе в области концентраций 0,02 – 0,10 мг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят, как указано в фармакопейной статье.

Раствор стандартного образца глюкозы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,1 г (точная навеска) фармакопейного стандартного образца глюкозы, растворяют в воде или как указано в фармакопейной статье, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2,0 мл полученного раствора, доводят растворителем до метки и перемешивают. Полученный раствор содержит 0,02 мг/мл глюкозы.

Раствор сравнения. В пробирку помещают 3 мл воды, охлаждают на ледяной бане, прибавляют 6 мл антронового реактива 0,2 %.

В пробирку помещают 3,0 мл испытуемого раствора, охлаждают на ледяной бане и осторожно прибавляют 6,0 мл антронового реактива 0,2 %, перемешивают и немедленно нагревают на водяной бане в течение времени, указанного в фармакопейной статье. Охлаждают и измеряют оптическую плотность испытуемого раствора в максимуме поглощения при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора фармакопейного стандартного образца глюкозы, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Построение калибровочного графика. Вместо использования одного стандартного раствора, если указано в фармакопейной статье, строят калибровочный график, используя разведённые растворы стандартного образца глюкозы с концентрацией от 0,01 до 0,05 мг/мл.

Содержание сахаров в 1 мл испытуемого раствора определяют по калибровочной кривой зависимости оптической плотности калибровочных растворов от содержания стандартного образца глюкозы в 1 мл растворителя.

При анализе декстранов учитывают, что 1 г глюкозы соответствует 0,94 г декстранов.

Метод 2

При нагревании пентоз (или их фосфорных производных) в присутствии кислот от них отщепляется вода и образуется фурфурол; в присутствии орцина и железа(III) хлорида при этом появляется зелёное окрашивание. Чувствительность метода определения значительно выше с рибозой, чем с дезоксирибозой и гексозами.

Железа(III) хлорида раствор 0,05 % в хлористоводородной кислоте концентрированной. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,05 г (точная навеска) FeCl₃·6H₂O, растворяют в хлористоводородной кислоте концентрированной и доводят объём раствора водой до метки. Срок годности раствора 1 месяц.

Орцина раствора 10 % в этаноле. В мерную колбу из тёмного стекла вместимостью 100 мл помещают 10 г (точная навеска) орцина, растворяют в этаноле и доводят объём раствора тем же растворителем. Раствор используют свежеприготовленным.

Испытуемый раствор. Готовят, как указано в фармакопейной статье.

Раствор стандартного образца рибозы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 25 г (точная навеска) фармакопейного стандартного образца рибозы, растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мл полученного раствора и доводят объём раствора водой до метки. Раствор используют свежеприготовленным.

Раствор сравнения. К 2,0 мл железа(III) хлорида раствора 0,05 % в хлористоводородной кислоте концентрированной прибавляют 2 мл воды, смесь встряхивают и прибавляют 0,2 мл орцина раствора 10 % в этаноле. Пробирку нагревают на водяной бане в течение 20 мин, с последующим охлаждением в ледяной воде.

В пробирку помещают 2,0 мл испытуемого раствора с содержанием рибозы 2,5 – 25,0 мг/мл, прибавляют 2,0 мл железа(III) хлорида раствор 0,05 % в хлористоводородной кислоте концентрированной, смесь встряхивают и прибавляют 0,2 мл орцина раствора 10 % в этаноле. Пробирку нагревают на водяной бане в течение 20 мин, с последующим охлаждением в ледяной воде, и измеряют оптическую плотность испытуемого раствора в максимуме поглощения при длине волны 670 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора фармакопейного стандартного образца рибозы, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Построение калибровочного графика. В 6 пробирок вносят 0,10, 0,20, 0,40, 0,60, 0,80 и 1,0 мл раствора фармакопейного стандартного образца рибозы, прибавляют воду до 2,0 мл и проводят те же операции, что и с испытуемым раствором.

Содержание сахаров (пентоз) в 1 мл испытуемого раствора находят по калибровочному графику зависимости оптической плотности калибровочных растворов от содержания рибозы в мг/мл.

Метод 3

Метод основан на цветной реакции моносахаров с пикриновой кислотой, протекающей с образованием пикраминовой кислоты в результате восстановления сахаром группы – NO₂ до – NH₂. Интенсивность образовавшейся окраски пропорциональна количеству определяемого сахара (0,1 – 0,8 мг/мл) в испытуемом растворе.

Испытуемый раствор. Готовят, как указано в фармакопейной статье.

Раствор стандартного образца глюкозы. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 0,05 г (точная навеска) фармакопейного стандартного образца глюкозы, растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки.

Срок годности раствора 10 сут при хранении в прохладном, защищённом от света месте.

Раствор сравнения. К 1,0 мл пикриновой кислоты раствора 1 % прибавляют 3,0 мл натрия карбоната раствора 20 % и количество воды, равного количеству испытуемого раствора. Колбу нагревают на водяной бане в течение 10 мин, охлаждают до комнатной температуры и доводят объём раствора водой до метки.

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают точное количество испытуемого раствора указанного в фармакопейной статье, 1,0 мл пикриновой кислоты раствора 1 %, и 3,0 мл натрия карбоната раствора 20 %. Колбу нагревают на водяной бане в течение 10 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят объём раствора водой до метки и  измеряют оптическую плотность испытуемого раствора в максимуме поглощения при длине волны (от 440 до 460 нм)  в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора фармакопейного стандартного образца глюкозы, приготовленного аналогично испытуемому раствору.