2.3. Фармацевтические субстанции животного происхождения

ФС.2.3.0005. Протамина сульфат

29.10.202430.10.2024 Виктор 0 Комментариев

утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377

Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.

Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Протамина сульфат	ФС.2.3.0005
Протамина сульфат
Protamini sulfas	Взамен ФС 42-1256-79

[9009-65-8]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Сульфаты основных пептидов, извлечённых из сперматозоидов или молоки рыб, обычно видов Salmonidae. Связывается с гепарином в растворе, ингибируя его антикоагулянтную активность; в условиях анализа это связывание приводит к образованию осадка. В расчёте на высушенное вещество 1 мг протамина сульфата осаждает не менее 100 МЕ гепарина.

Содержит не менее 90,0 % и не более 110,0 % протамина сульфата в пересчёте на сухое и свободное от серной кислоты вещество.

СВОЙСТВА

Описание. Белый или почти белый порошок со слабым характерным запахом.

*Гигроскопичен.

Растворимость. Умеренно растворим в воде, практически нерастворим в спирте 96 %.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Антигепариновая активность. Должна соответствовать требованиям раздела «Количественное определение».

2. ВЭЖХ. Время удерживания четырёх основных пиков (протаминовых пептидов A, B, C, D ) на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пиков (протаминовых пептидов A, B, C, D), на хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата (раздел «Родственные примеси»).

Относительное содержание пептидов A, B, C, D в субстанции рассчитывают методом внутренней нормализации. Содержание пептида А в испытуемом растворе должно составлять от 13 до 18 %; пептида В – от 21 до 28 %; пептида С – от 31 до 38 %; пептида D – от 19 до 24 %.

3. Качественная реакция. К 0,5 мл раствора А, полученного в испытании «Прозрачность раствора», прибавляют 4,5 мл воды, 1,0 мл натрия гидроксида раствора 10 %, 1,0 мл a-нафтола раствора 0,1 % и перемешивают. Смесь охлаждают до 5 °С и прибавляют 0,5 мл натрия гипобромита раствора; должно образоваться красное окрашивание.

4. Качественная реакция. Субстанция должна давать реакцию на сульфаты (ОФС «Общие реакции на подлинность»).

ИСПЫТАНИЯ

Удельное вращение. От –65 до –85 в пересчёте на сухое вещество (1 % раствор субстанции в хлористоводородной кислоты растворе 0,1 М, ОФС «Оптическое вращение»).

Прозрачность раствора. Растворяют 0,2 г субстанции в 10 мл воды (раствор А). К 2,5 мл полученного раствора прибавляют 7,5 мл воды. Полученный раствор должен выдерживать сравнение с эталоном II (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»).

Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании «Прозрачность раствора», должен выдерживать сравнение с эталоном BY₆ или Y₆ (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2).

Оптическая плотность. Оптическая плотность 1,0 % раствора субстанции в воде, измеренная при длине волн от 260 до 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, не должна превышать 0,1 (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).

рН. От 6,0 до 7,5 (1,0 % раствор субстанции, ОФС «Ионометрия», метод 3).

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Растворы используют свежеприготовленными.

Подвижная фаза А (ПФА). Трифторуксусная кислота—ацетонитрил—вода 1:50:950.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Трифторуксусная кислота—ацетонитрил—вода 1:500:500.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 30 мг субстанции, растворяют в 400 мкл хлористоводородной кислоты 6 М и доводят объём раствора хлористоводородной кислотой 0,01 М до метки.

Раствор стандартного образца протамина сульфата. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 3 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца протамина сульфата, содержащего пептиды А, В, С, D, растворяют в 40 мкл хлористоводородной кислоты раствора 6 М и доводят объём раствора хлористоводородной кислоты раствором 0,01 М до метки.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл раствора стандартного образца протамина сульфата и доводят объём раствора хлористоводородной кислоты раствором 0,01 М до метки.

Условия хроматографирования

Колонка	150 × 4,6 мм, силикагель октадецилсилильный, с пористой поверхностью на непористой основе, эндкепированный, для хроматографии, 3,6 мкм;
Температура колонки	45 °С;
Скорость потока	1,5 мл/мин;
Детектор	спектрофотометрический, 210 нм;
Температура автосамплера	5 °С;
Объём пробы	30 мкл;
Время хроматографирования	25 мин.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0–2	95	5
2–17	95 → 80	5 → 20
17–17,2	80 → 20	20 → 80
17,2–20	20	80

Хроматографируют раствор для проверки пригодности хроматографической системы, раствор стандартного образца протамина сульфата и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Пептид А – 1 (от 9 до 13 мин); пептид В – около 1,05; пептид C – около 1,10; пептид D – около 1,15.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата:

— должно наблюдаться 4 основных пика (пептиды от А до D), время удерживания которых должны находиться в пределах от 8 до 17 мин;

— разрешение (R) между пиками пептида А и пептида B должно быть не менее 2,0; между пиками пептида B и пептида C должно быть не менее 2,0; между пиками пептида C и пептида D должно быть не менее 2,0;

— фактор асимметрии (A_s) пика пептида А должен быть не более 1,8; пика пептида B – не более 1,5; пика пептида С– не более 2,5; пика пептида D – не более 2,2;

— относительное стандартное отклонение суммы площадей пиков пептидов A, B, C и D – не более 2% (6 введений);

— отношение сигнал/шум (S/N) для пика пептида А на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы – не менее 10.

Допустимое содержание примесей. Суммарное содержание примесей в субстанции в процентах () вычисляют по формуле:

где		—	сумма площадей пиков пептидов A, B, C и D на хроматограмме испытуемого раствора;
	ΣS	—	сумма площадей всех пиков на хроматограмме испытуемого раствора.

Допустимое суммарное содержание примесей – не более 8,0 %.

При суммарном содержании примесей менее 0,5 % результат испытания указывают как «менее 0,5 %».

Потеря в массе при высушивании. Не более 5,0 % (ОФС «Потеря в массе при высушивании»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Азот. От 21,0 до 26,0 %, в пересчёте на сухое вещество (ОФС «Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля, метод 1). Для определения используют 70 мг субстанции и проводят минерализацию в течение 3–4 часов. В качестве титранта используют 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты.

Железо. Не более 0,001 % (ОФС «Железо», метод 2). Растворяют 1,0 г субстанции при нагревании в 10 мл воды.

Сульфаты. Не менее 16 % и не более 24 %, в пересчёте на сухое вещество. В химический стакан помещают 0,15 г (точная навеска) субстанции, растворяют в 15 мл воды, прибавляют 5 мл хлористоводородной кислоты разведённой 7,3 %, нагревают до кипения и медленно прибавляют к кипящему раствору 10 мл бария хлорида раствора 10 %. Накрывают стакан, нагревают в течение 1 ч на водяной бане и фильтруют. Осадок промывают несколько раз горячей водой, до отрицательной реакции на хлориды, высушивают и прокаливают в предварительно взвешенном тигле при температуре от 550 до 650 °С до постоянной массы.

1,0 г остатка соответствует 0,4117 г сульфатов SO₄.

Сульфатная зола. Не более 0,5 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Ртуть. Не более 0,001 %.

Растворитель. Азотная кислота концентрированная—серная кислота концентрированная 1:1.

Испытуемый раствор. В коническую колбу вместимостью 250 мл помещают 2,0 г субстанции, прибавляют 20,0 мл растворителя, кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, охлаждают и осторожно разбавляют водой. Кипятят до полного исчезновения паров азотной кислоты. Смесь охлаждают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводят объём раствора водой до метки и фильтруют. Переносят 50,0 мл фильтрата в делительную воронку, встряхивают последовательно с небольшими порциями хлороформа до обесцвечивания хлороформного слоя. Отделяют хлороформный слой. К водному слою прибавляют 25,0 мл серной кислоты разведённой 9,8 %, 115,0 мл воды и 10,0 мл гидроксиламина гидрохлорида раствора 20 %. Титруют дитизона раствором 0,0012 %, после каждого прибавления титранта смесь тщательно перемешивают, к концу титрования смесь оставляют для разделения слоёв. Отделяют хлороформный слой и продолжают титровать до появления синевато-зелёного окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт.

Рассчитывают содержание ртути, используя эквивалент в мкг ртути на 1 мл титранта, определённый при установке титра дитизона раствора 0,0012 %.

Тяжёлые металлы. Не более 0,002 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 3Б) в остатке, полученном в испытании «Сульфатная зола», с использованием эталонного раствора 2.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС «Аномальная токсичность»). Тест-доза – 0,5 мг субстанции в 0,5 мл воды для инъекций на мышь. Срок наблюдения 48 ч.

Бактериальные эндотоксины. Не более 2,33 ЕЭ на 1 мг субстанции (ОФС «Бактериальные эндотоксины»).

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Антигепариновая активность. Определение проводят методом титриметрии.

Все испытуемые растворы и раствор стандартного образца протамина сульфата готовятся в двух повторностях; для каждого раствора проводится 3 определения.

Испытуемый раствор А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 15 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

Испытуемый раствор Б. К 10,0 мл испытуемого раствора А прибавляют 5,0 мл воды и перемешивают.

Испытуемый раствор В. К 10,0 мл испытуемого раствора А прибавляют 20,0 мл воды и перемешивают.

Раствор стандартного образца гепарина натрия (титрант). Готовят раствор фармакопейного стандартного образца гепарина натрия в воде с концентрацией гепарина натрия около 170 МЕ/мл.

В кювету помещают 1,5 мл титруемого раствора (испытуемый раствор А; испытуемый раствор Б; испытуемый раствор В), устанавливают подходящую длину волны в видимой области спектра, прибавляют титрант в малых количествах до резкого увеличения абсорбции и записывают объём.

Антигепариновая активность. Количество связанного гепарина натрия в МЕ на 1 мг субстанции (A) вычисляют по формуле:

где	–	объём титранта, израсходованный на титрование каждого испытуемого раствора, мл;
	–	концентрация гепарина натрия, МЕ/мл;
	–	номинальная концентрация протамина сульфата в каждом испытуемом растворе, мг/мл.

Относительное стандартное отклонение антигепариновой активности для каждого испытуемого раствора должно быть не более 5,0 %.

За результат антигепариновой активности принимают среднее значение из 18 определений.

Белок. Определение проводят методом ВЭЖХ в условиях испытания «Родственные примеси» со следующими изменениями.

Хроматографируют раствор стандартного образца протамина сульфата и испытуемый раствор.

Содержание протамина сульфата в процентах () вычисляют по формуле:

где		—	среднее значение суммы площадей пиков пептидов A, B, C, D на хроматограмме испытуемого раствора;
	S₀	—	среднее значение суммы площадей пиков пептидов A, B, C, D на хроматограмме раствора стандартного образца протамина сульфата;
		—	навеска субстанции, мг;
		—	навеска стандартного образца протамина сульфата, мг;
		—	содержание протамина в стандартном образце протамина сульфата, мг;
	W	—	потеря в массе при высушивании,%;
		—	содержание сульфатов в субстанции, в %.