ФС.2.1.0352. Аспарагиновая кислота
утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377
Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.
Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
| Аспарагиновая кислота | ФС.2.1.0352 |
| Аспарагиновая кислота | |
| Acidum asparticum | Вводится впервые |
|
|
|
| C4H7NO4 |
М.м. 133,10 |
| [56-84-8] |
|
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
(2S)-2-Аминобутандиовая кислота.
L-Аспарагиновая кислота.
Cодержит не менее 98,5 % и не более 101,5 % аспарагиновой кислоты C4H7NO4 в пересчёте на сухое вещество.
СВОЙСТВА
Описание. Белый или почти белый кристаллический порошок или бесцветные кристаллы.
Растворимость. Мало растворим в воде, практически нерастворим в спирте 96 %.
*Растворяется в разбавленных растворах минеральных кислот и щелочей.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
1. ИК-спектрометрия (ОФС «Спектрометрия в средней инфракрасной области»). Инфракрасный спектр субстанции в области от 4000 до 400 см–1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру фармакопейного стандартного образца аспарагиновой кислоты.
2. ТСХ (ОФС «Тонкослойная хроматография»).
Вещества, окрашивающиеся нингидрином.
Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля.
Подвижная фаза (ПФ). Уксусная кислота ледяная—вода—бутанол 20:20:60.
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 10 мг субстанции, растворяют в аммиака растворе 10 % и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор стандартного образца аспарагиновой кислоты. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца аспарагиновой кислоты, растворяют в 2 мл аммиака раствора 10 % и доводят объём раствора водой до метки.
На линию старта пластинки наносят по 5 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца аспарагиновой кислоты. Пластинку с нанесёнными пробами сушат на воздухе, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдёт около 80–90 % длины пластинки от линии старта, её вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, опрыскивают нингидрина раствором 0,2 %, выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100–105 °С в течение 15 мин и просматривают в видимом свете.
Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора, по положению, величине и окраске должна соответствовать зоне адсорбции аспарагиновой кислоты на хроматограмме раствора стандартного образца аспарагиновой кислоты.
ИСПЫТАНИЯ
Удельное вращение. От +24,0 до +26,0 в пересчёте на сухое вещество (8 % раствор субстанции в хлористоводородной кислоты растворе 6 М, ОФС «Оптическое вращение»).
Прозрачность раствора. Раствор 0,5 г субстанции в 10 мл хлористоводородной кислоты растворе 1 М должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»).
Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании «Прозрачность раствора», должен выдерживать сравнение с эталоном BY6 (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2).
pH. От 2,5 до 3,5 (0,5 г субстанции растворяют в 100 мл кипящей воды и охлаждают, ОФС «Ионометрия»,метод 3).
Родственные примеси
1. Энантиомерная чистота. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).
Все растворы используют свежеприготовленными.
Подвижная фаза (ПФ): 2-пропанол—меди сульфата пентагидрата раствор 0,5 г/л 5:95 (об/об).
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,10 г (точная навеска) субстанции, растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.
Раствор стандартного образца примеси I. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,10 г (точная навеска) фармакопейного стандартного образца D-аспарагиновой кислоты (примесь I), растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.
Раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,3 мл раствора стандартного образца примеси I и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,10 г (точная навеска) субстанции, растворяют в 90 мл воды, прибавляют 0,3 мл раствора сравнения и доводят объём раствора водой до метки.
Примечание
Примесь I (D-аспарагиновая кислота): (2R)-2-аминобутандиовая кислота [1783-96-6].
Хроматографические условия
| Колонка | 150 × 4,6 мм, силикагель для хиральной хроматографии, модифицированный L-пеницилламином, 5 мкм; |
| Температура колонки | 30 °С; |
| Скорость потока | 1,0 мл/мин; |
| Детектор | спектрофотометрический, 230 нм; |
| Объём пробы | 20 мкл; |
| Время хроматографирования | 24 мин. |
Хроматографируют раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы, раствор стандартного образца примеси I, раствор сравнения и испытуемый раствор.
Относительное время удерживания соединений. Аспарагиновая кислота – 1 (около 12 мин); примесь I – около 0,85.
Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы разрешение (RS) между пиками примеси I и аспарагиновой кислоты должно быть не менее 2,0.
Содержание примеси I в субстанции в процентах (Х) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика примеси I на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
|
– | площадь пика примеси I на хроматограмме раствора сравнения; | |
|
|
– | навеска субстанции, мг; | |
|
|
– | навеска фармакопейного стандартного образца примеси I, мг; | |
|
|
– | содержание примеси I в фармакопейном стандартном образце примеси I, %. |
Допустимое содержание примеси I не более 0,3 %.
2. Другие дикарбоновые кислоты. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).
Все растворы используют свежеприготовленными.
Подвижная фаза (ПФ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 900 мл воды, прибавляют 4,0 мл серной кислоты раствора 3,8 М, доводят объём раствора водой до метки.
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 г (точная навеска) субстанции, прибавляют 2 мл хлористоводородной кислоты раствора 6 М и встряхивают до полного растворения в течение 10–20 мин, доводят объём раствора водой до метки.
Раствор яблочной кислоты (А). В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 20 мг (точная навеска) яблочной кислоты (примесь А), растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор яблочной кислоты (Б). В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл раствора яблочной кислоты (А) и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор малеиновой кислоты. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 10 мг (точная навеска) малеиновой кислоты (примесь Н), растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор фумаровой кислоты. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 10 мг (точная навеска) фумаровой кислоты (примесь B), растворяют в воде и доводят объём раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл раствора малеиновой кислоты и доводят объём раствором яблочной кислоты (А) до метки.
Примечание
Примесь А (яблочная кислота): (2RS)-2-гидроксибутандиовая кислота [6915-15-7].
Примесь В (фумаровая кислота): (2E)-бут-2-ендиовая кислота [110-17-8].
Примесь H (малеиновая кислота): (2Z)-бут-2-ендиовая кислота [110-16-7].
Хроматографические условия
| Колонка | 300 × 7,8 мм, сильная катионообменная смола, 9 мкм; |
| Температура колонки | 30 °С; |
| Скорость потока | 0,6 мл/мин; |
| Детектор | спектрофотометрический, 214 нм; |
| Объём пробы | 10 мкл; |
| Время хроматографирования | 4-кратное от времени удерживания пика примеси B. |
Хроматографируют раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы, растворы яблочной кислоты (А и Б), растворы малеиновой и фумаровой кислот и испытуемый раствор.
Относительное время удерживания соединений. Примесь H – 1 (около 7,5 мин); примесь А – около 1,2; примесь B – около 2,0.
Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей используют относительное время удерживания соединений, хроматограмму раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы (примеси A и H) и хроматограмму раствора фумаровой кислоты (примесь B).
Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы разрешение (RS) между пиками примеси H и примеси А должно быть не менее 1,5.
Содержание примеси А (яблочной кислоты) в субстанции в процентах (
) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика примеси А на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
S0 |
– | площадь пика яблочной кислоты на хроматограмме раствора яблочной кислоты (Б); | |
|
a |
– | навеска субстанции, мг; | |
|
ɑ0 |
– | навеска яблочной кислоты, мг; | |
|
P |
– | содержание основного вещества в яблочной кислоте, %. |
Содержание каждой из примесей В и Н в субстанции в процентах (
) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика примеси В или H на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
S0 |
– | площадь пика малеиновой кислоты на хроматограмме раствора малеиновой кислоты; | |
|
a |
– | навеска субстанции, мг; | |
|
ɑ0 |
– | навеска малеиновой кислоты, мг; | |
|
P |
– | содержание основного вещества в малеиновой кислоте, %. |
Содержание любой другой примеси в субстанции в процентах (Xi) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика любой другой примеси на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
S0 |
– | площадь пика яблочной кислоты на хроматограмме раствора яблочной кислоты (Б); | |
|
a |
– | навеска субстанции, мг; | |
|
ɑ0 |
– | навеска яблочной кислоты, мг; | |
|
P |
– | содержание основного вещества в яблочной кислоте, %. |
Допустимое содержание примесей:
— примесь А – не более 0,2 %;
— примесь B – не более 0,10 %;
— примесь Н – не более 0,10 %;
— любая другая примесь – не более 0,10 %;
— сумма примесей – не более 0,3 %.
Не учитывают примеси, содержание каждой из которых менее 0,05 %.
3. Нингидрин-положительные вещества. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аминокислотный анализ» (метод 1).
Раствор A. Хлористоводородной кислоты раствор 0,01 М или буферный раствор для пробоподготовки, подходящий для используемого прибора.
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 30 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в растворе A и доводят объём тем же растворителем до метки.
Раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объём раствором A до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 2,0 мл полученного раствора и доводят объём раствором А до метки.
Раствор пролина. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 30 мг (точная навеска) пролина, растворяют в растворе A и доводят объём тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствором А до метки.
Стандартный раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 30 мг аланина (примесь D), 60 мг аспарагина (примесь G) и 30 мг глутаминовой кислоты (примесь С), растворяют в растворе А и доводят объём тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствором А до метки.
Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 30 мг изолейцина и 30 мг лейцина, растворяют в растворе A и доводят объём тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 200 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствором А до метки.
Контрольный раствор. Раствор A.
Примечание
Примесь С (глутаминовая кислота): (2S)-2-аминопентандиовая кислота [56-86-0].
Примесь D (аланин): (2S)-2-аминопропановая кислота [56-41-7].
Примесь G (аспарагин): (2S)-2-амино-3-карбамоилпропановая кислота [70-47-3].
Вводят в аминокислотный анализатор подходящие равные объёмы контрольного раствора, раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы, стандартного раствора, раствора пролина, раствора сравнения и испытуемого раствора. Используют программу элюирования, подходящую для определения содержания протеиногенных аминокислот.
Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы разрешение (RS) между пиками изолейцина и лейцина должно быть не менее 1,5.
Содержание каждой из примесей C, D и G в субстанции в процентах (Х) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика примеси C, D или G на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
|
– | площадь пика примеси C, D или G на хроматограмме стандартного раствора; | |
|
|
– | навеска субстанции, взятая для приготовления испытуемого раствора, мг; | |
|
|
– | навеска фармакопейного стандартного образца примеси C, D или G, взятая для приготовления стандартного раствора, мг; | |
|
P |
– | содержание основного вещества в фармакопейном стандартном образце примеси C, D или G соответственно, %. |
Содержание любого другой примеси (нингидрин-положительного вещества), зарегистрированной при длине волны 570 нм, (
) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика любой другой примеси на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
|
– | площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения. |
Содержание любой другой примеси (нингидрин-положительного вещества), зарегистрированной при длине волны 440 нм, (
) вычисляют по формуле:
| где |
|
– | площадь пика любой другой примеси на хроматограмме испытуемого раствора; |
|
|
– | площадь пика пролина на хроматограмме стандартного раствора; | |
|
|
– | навеска субстанции, мг; | |
|
|
– | навеска пролина, взятая для приготовления раствора пролина, мг; | |
|
|
– | содержание основного вещества в фармакопейном стандартном образце пролина, %. |
Если примесь регистрируется выше порога игнорирования как при 570 нм, так и при 440 нм, для количественного расчёта используют результат, полученный при 570 нм.
Допустимое содержание примесей:
— примеси С, D и G – не более 0,2 % каждая;
— любая другая примесь – не более 0,10 %;
— сумма примесей – не более 1,0 %.
Не учитывают примеси, содержание каждой из которых менее 0,05 %.
Потеря в массе при высушивании. Не более 0,5 % (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.
Аммоний. Не более 0,02 % (ОФС «Аммоний»). Взбалтывают 0,15 г субстанции с 15 мл воды свободной от аммиака в течение 5 мин и фильтруют. Для определения используют 10 мл фильтрата.
Железо. Не более 0,001 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Железо» (метод 2) в зольном остатке, полученном после сжигания 1,0 г субстанции (ОФС «Сульфатная зола»), с использованием железа стандартного раствора 10 мкг/мл.
Сульфаты. Не более 0,03 % (ОФС «Сульфаты», метод 1). В 4 мл хлористоводородной кислоты разведённой 8,3 % растворяют 0,5 г субстанции и доводят объём раствора водой до 15 мл. Для определения используют 10 мл раствора.
Хлориды. Не более 0,02 % (ОФС «Хлориды»). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 0,25 г субстанции, прибавляют в 3 мл азотной кислоты раствора 12,5 %, доводят объём раствора водой до метки. Для определения используют 10 мл раствора.
Сульфатная зола. Не более 0,1 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.
Тяжёлые металлы. Не более 0,001 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 2), в зольном остатке, полученном в испытании «Сульфатная зола», с использованием эталонного раствора 1.
Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».
**Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС «Аномальная токсичность»). Тест-доза – 7,5 мг субстанции в 0,5 мл натрия хлорида раствора 0,9 % на мышь, внутривенно в течение 30 с. Срок наблюдения – 48 ч. Испытуемый раствор с концентрацией 15 мг/мл: к навеске субстанции 900 мг прибавляют 3,4 мл раствора натрия гидроксида 2 М и нагревают до 90–100 °С до полного растворения субстанции, доводят объём раствора до 10 мл раствором натрия хлорида 0,9 %. К 1,0 мл полученного раствора прибавляют 5 мл раствора натрия хлорида 0,9 %.
**Бактериальные эндотоксины. Не более 10 ЕЭ на 1 г аспарагиновой кислоты (ОФС «Бактериальные эндотоксины»).
Для проведения испытания готовят исходный раствор субстанции с концентрацией 0,01 г субстанции в 1 мл воды для определения бактериальных эндотоксинов. При приготовлении исходного раствора допускается нагревание до температуры 70–80 °С, до полного растворения субстанции. Разведения исходного раствора субстанции выполняют с использованием растворов, корректирующих значение pH.
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определение проводят методом титриметрии (ОФС «Титриметрия (титриметрические методы анализа)»).
Растворяют 0,1 г (точная навеска) субстанции (при слабом нагревании) в 50 мл воды, охлаждают и титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до перехода окраски из жёлтой в синюю (индикатор – 0,1 мл бромтимолового синего раствор 0,05 %).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида соответствует 13,31 мг аспарагиновой кислоты C4H7NO4.
ХРАНЕНИЕ
В плотно закрытой упаковке, в защищённом от света месте.
*Приводится для информации
**Испытание проводят для субстанции, предназначенной для производства лекарственных препаратов для парентерального применения.