ФС.2.1.0559. Рибофлавин
утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377
Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.
Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Рибофлавин | ФС.2.1.0559 |
Рибофлавин | |
Riboflavinum | Взамен ФС 42-2954-93 |
|
|
C17H20N4O6 |
М.м. 376,36 |
[83-88-5] |
|
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
7,8-Диметил-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил]бензо[g]птеридин-2,4(3H,10H)-дион.
Субстанция представляет собой продукт ферментации.
Содержит не менее 97,0 % и не более 103,0 % рибофлавина C17H20N4O6 в пересчёте на сухое вещество.
СВОЙСТВА
Описание. Жёлтый или оранжево-жёлтый кристаллический порошок.
*Проявляет полиморфизм. Растворы рибофлавина неустойчивы на свету, особенно в присутствии щелочей.
Растворимость. Очень мало растворим в воде, практически нерастворим в спирте 96 %.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
1. Спектрофотометрия (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).
Испытуемый раствор. Смешивают равные объёмы испытуемого раствора, полученного в испытании «Количественное определение», и воды.
Спектр поглощения испытуемого раствора должен иметь максимумы при 223 нм, 267 нм, 373 нм и 444 нм. Отношение значений оптических плотностей A373/A267 должно быть от 0,31 до 0,33. Отношение значений оптических плотностей A444/A267 должно быть от 0,36 до 0,39.
2. Определение проводят методом ТСХ (ОФС «Тонкослойная хроматография»).
Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля (2-10 мкм).
Подвижная фаза (ПФ). Вода.
Испытуемый раствор. К 25 мг субстанции прибавляют 10 мл воды, встряхивают в течение 5 мин и фильтруют.
Раствор стандартного образца рибофлавина. К 25 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца рибофлавина прибавляют 10 мл воды, встряхивают в течение 5 мин и фильтруют.
На линию старта пластинки наносят:
— 1 точка: 2 мкл метиленхлорида и затем 2 мкл испытуемого раствора;
— 2 точка: 2 мкл метиленхлорида и затем 2 мкл раствора стандартного образца рибофлавина.
После каждого последовательного нанесения в точках 1 и 2 пластинку подсушивают в токе холодного воздуха, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдёт около 80–90 % длины пластинки от линии старта, её вынимают из камеры, сушат в потоке холодного воздуха до удаления следов растворителей и просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.
Результат. Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора по положению, величине и цвету флуоресценции должна соответствовать зоне адсорбции рибофлавина на хроматограмме раствора стандартного образца рибофлавина.
3. Качественная реакция. Растворяют 1 мг субстанции в 100 мл воды. В проходящем свете раствор должен иметь бледно-зеленовато-жёлтый цвет, в отражённом свете — интенсивную желтовато-зелёную флуоресценцию, которая должна исчезать при добавлении минеральных кислот или щелочей.
ИСПЫТАНИЯ
Удельное вращение. От –115,0 до –135,0 в пересчёте на сухое вещество (ОФС «Оптическое вращение»).
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 50 мг субстанции, растворяют в натрия гидроксида растворе 0,05 М и доводят объём раствора тем же растворителем до метки. Раствор используют в течение 30 мин.
Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).
Все растворы используют сразу после приготовления и защищают от света.
Подвижная фаза А (ПФА). Фосфорная кислота концентрированная—вода 1:1000.
Подвижная фаза Б (ПФБ). Ацетонитрил.
Растворитель. Натрия ацетата раствор 0,1 М.
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,12 г субстанции, растворяют в 10 мл натрия гидроксида раствора 0,1 М, при необходимости обрабатывая ультразвуком, и доводят объём раствора растворителем до метки.
Раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объём раствора растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора растворителем до метки.
Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг субстанции, растворяют в 1 мл натрия гидроксида раствора 0,5 М, выдерживают в дневном свете в течение 1,5 ч, прибавляют 0,5 мл уксусной кислоты разведённой 30 % и доводят объём раствора водой до метки (содержит примеси A и B).
Раствор для идентификации пиков. Содержимое флакона фармакопейного стандартного образца рибофлавина для идентификации пиков, содержащего примеси С и D, растворяют в 1 мл смеси ПФБ—ПФА 1:9, при необходимости обрабатывая ультразвуком.
Примечание
Примесь А: 7,8,10-триметилбензо[g]птеридин-2,4(3H,10H)-дион [1088-56-8].
Примесь В: 7,8-диметилбензо[g]птеридин-2,4(1H,3H)-дион [1086-80-2].
Примесь С: 6,7-диметил-8-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил]птеридин-2,4(3H,8H)-дион [5118-16-1].
Примесь D: 8-(гидроксиметил)-7-метил-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил]бензо[g]птеридин-2,4(3H,10H)-дион [52134-62-0].
Хроматографические условия
Колонка | 250 × 4,6 мм, силикагель октадецилсилильный эндкепированный для хроматографии, 5 мкм; |
Температура колонки | 25 °С; |
Скорость потока | 1,0 мл/мин; |
Детектор | спектрофотометрический, 267 нм; |
Объём пробы | 10 мкл. |
Режим хроматографирования
Время, мин |
ПФА, % |
ПФБ, % |
0–5 |
90 |
10 |
5–20 |
90 → 80 |
10 → 20 |
20–25 |
80 |
20 |
25–35 |
80 → 50 |
20 → 50 |
35–45 |
50 |
50 |
Хроматографируют раствор для идентификации пиков, раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы, раствор сравнения и испытуемый раствор.
Относительное время удерживания соединений. Рибофлавин – 1 (около 16 мин); примесь С – около 0,2; примесь D – около 0,5; примесь А – около 1,4; примесь В – около 1,9.
Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей С и D используют относительное время удерживания соединений, хроматограмму раствора для идентификации пиков и хроматограмму, прилагаемую к стандартному образцу рибофлавина для идентификации пиков.
Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы разрешение (RS) между пиками примеси А и примеси В должно быть не менее 5.
Поправочные коэффициенты. Для расчёта содержания примесей площади пиков следующих примесей умножают на соответствующие поправочные коэффициенты: примесь А – 0,7; примесь В и D – 1,4, примесь С – 2,3.
Допустимое содержание примесей. На хроматограмме испытуемого раствора:
— площадь пика примеси А не должна превышать 0,25 площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,025 %);
— площадь пика каждой из примесей B, С и D не должна превышать двукратную площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,2 %);
— площадь пика любой другой примеси не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,1 %);
— сумма площадей пиков всех примесей не должна превышать пятикратную площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,5 %).
Не учитывают пики, кроме пика примеси А, площадь которых составляет менее 0,5-площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения (менее 0,05 %).
Потеря в массе при высушивании. Не более 1,5 % (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.
Сульфатная зола. Не более 0,1 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.
Тяжёлые металлы. Не более 0,001 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Тяжёлые металлы» (метод 3А или 3Б), в зольном остатке, полученном в испытании «Сульфатная зола» с использованием эталонного раствора 1.
**Бактериальные эндотоксины. Не более 7,1 ЕЭ на 1 мг рибофлавина (ОФС «Бактериальные эндотоксины»).
Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определение проводят методом спектрофотометрии (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).
Все растворы защищают от света.
Раствор натрия ацетата. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,4 г натрия ацетата тригидрата, растворяют воде и доводят объём раствора водой до метки.
Испытуемый раствор. В мерную колбу из тёмного стекла вместимостью 500 мл помещают 65 мг (точная навеска) субстанции, суспендируют с 5 мл воды до полного смачивания, прибавляют 5 мл натрия гидроксида раствора 8,5 %, перемешивают до полного растворения, тотчас прибавляют 100 мл воды, 2,5 мл уксусной кислоты ледяной и доводят объём раствора водой до метки. В мерную колбу из тёмного стекла вместимостью 200 мл помещают 20,0 мл полученного раствора, прибавляют 3,5 мл раствора натрия ацетата и доводят объём раствора водой до метки.
Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 444 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя в качестве раствора сравнения воду.
Содержание рибофлавина C17H20N4O6 в субстанции в пересчёте на сухое вещество в процентах (Х) вычисляют по формуле:
где |
A |
— | оптическая плотность испытуемого раствора; |
328 |
— | удельный показатель поглощения рибофлавина, (); | |
— | навеска субстанции, г; | ||
— | потеря в массе при высушивании, %. |
ХРАНЕНИЕ
В герметично укупоренной упаковке, в защищённом от света месте.
*Приводится для информации.
**Испытание проводят для субстанции, предназначенной для производства лекарственных препаратов для парентерального применения.