ФС.2.1.0399. Глутатион
утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377
Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.
Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
| Глутатион | ФС.2.1.0399 |
| Глутатион | |
| Glutathionum | Вводится впервые |
|
|
|
| C10H17N3O6S |
М.м. 307,33 |
| [70-18-8] | |
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
L-γ-Глутамил-L-цистеинилглицин.
Cодержит не менее 98,0 % и не более 101,0 % глутатиона C10H17N3O6S в пересчёте на сухое вещество.
СВОЙСТВА
Описание. Белый или почти белый кристаллический порошок или бесцветные кристаллы.
Растворимость. Легко растворим в воде, очень мало растворим в этаноле 96 % и метиленхлориде.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ИК-спектрометрия (ОФС «Спектрометрия в средней инфракрасной области»). Инфракрасный спектр субстанции в области от 4000 до 400 см-1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру фармакопейного стандартного образца глутатиона.
ИСПЫТАНИЯ
Удельное вращение. От −15,5 до −17,5 в пересчёте на сухое вещество (4 % раствор субстанции в воде ОФС «Оптическое вращение»).
Прозрачность раствора. Раствор 5,0 г субстанции в 50 мл воды должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»).
Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании «Прозрачность раствора», должен быть бесцветным (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2).
Родственные примеси. Определение проводят методом капиллярного электрофореза (ОФС «Капиллярный электрофорез»).
Все растворы используют сразу после приготовления.
Ведущий электролит (ВЭ). В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 1,5 г натрия дигидрофосфата безводного, растворяют в 230 мл воды, доводят значение рН фосфорной кислотой концентрированной до 1,8 и доводят объём раствора водой до метки.
Раствор внутреннего стандарта А. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,1 г (точная навеска) фенилаланина, растворяют в ВЭ и доводят объём раствора ВЭ до метки.
Раствор внутреннего стандарта Б. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объём раствора ВЭ до метки.
Испытуемый раствор А. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,2 г (точная навеска) субстанции, растворяют в ВЭ и доводят объём раствора ВЭ до метки.
Испытуемый раствор Б. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,2 г (точная навеска) субстанции, растворяют в растворе внутреннего стандарта Б и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.
Стандартный раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 20 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в растворе внутреннего стандарта А и доводят объём раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора ВЭ до метки.
Раствор для проверки пригодности электрофоретической системы. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают по 5 мг L-цистеина, глутатиона окисленного и L-γ-глутамил-L-цистеина, растворяют в ВЭ и доводят объём раствора ВЭ до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,2 г субстанции, растворяют в 5 мл ВЭ, прибавляют 1,0 мл раствора внутреннего стандарта А, 2,0 мл полученного раствора и доводят объём раствора ВЭ до метки.
Контрольный раствор. ВЭ.
Примечание
Примесь А: L-цистеинилглицин [19246-18-5].
Примесь В (L-цистеин): (2R)-2-амино-3-сульфанилпропановая кислота [52-90-4].
Примесь С (глутатион окисленный): (2→2′)-бис(L-γ-глутамил-L-цистеинилглицин)дисульфид [27025-41-8].
Примесь D: L-γ-глутамил-L-цистеин [636-58-8].
Примесь E: неизвестная структура.
Электрофоретические условия
| Капилляр | кварцевая капиллярная, 50 см × 75 мкм; | ||
| Прекондиционирование нового капилляра |
Растворитель |
Время, мин |
Давление, кПа |
|
хлористоводородной кислоты раствор 0,1 М |
20 |
138; |
|
|
вода |
10 |
138; |
|
|
ВЭ |
40 |
350; |
|
| Для полного уравновешивания капилляра предыдущую стадию промывки повторяют при напряжении 20 кВ в течение 60 мин; | |||
| Прекондиционирование капилляра |
ВЭ |
40 |
138; |
| Промывка капилляра |
вода |
1 |
138; |
|
натрия гидроксида раствор 0,1 М |
2 |
138; |
|
|
вода |
1 |
138; |
|
|
хлористоводородной кислоты раствор 0,1 М |
3 |
138; |
|
|
ВЭ |
10 |
138; |
|
| Температура капилляра | 25 °C; | ||
| Детектор | спектрофотометрический, 200 нм; | ||
| Ввод пробы | 5 с·3,45 кПа; | ||
| Напряжение | 20 кВ; | ||
| Время анализа | 45 мин. | ||
Последовательно анализируют контрольный раствор, раствор для проверки пригодности электрофоретической системы, стандартный раствор, испытуемый раствор А и испытуемый раствор Б.
Относительное время миграции. Внутренний стандарт – 1 (около 14 мин); примесь А – около 0,77; примесь В – около 1,04; примесь Е – около 1,2; примесь С – около 1,26; примесь D – около 1,3.
Пригодность электрофоретической системы. На электрофореграмме испытуемого раствора А не должно быть пика, соответствующего по времени миграции пику внутреннего стандарта, при необходимости корректируют площадь внутреннего стандарта.
На электрофореграмме раствора для проверки пригодности электрофоретической системы:
— разрешение (RS) между пиками внутреннего стандарта и примеси В должно быть не менее 1,5, при необходимости увеличивают значение рН натрия гидроксида раствором 8,5 %;
— отношение максимум/минимум (p/v) между пиками примеси D и глутатиона должно быть не менее 2,5, при необходимости уменьшают значение рН фосфорной кислотой концентрированной.
Поправочные коэффициенты. Для расчёта содержания площади пиков следующих примесей умножают на соответствующие поправочные коэффициенты: примесь В – 3,0; примесь D – 1,4.
Содержание любой примеси в субстанции в процентах (Х) вычисляют по формуле:
| где |
B1 |
– |
отношение площади пика любой примеси к площади пика внутреннего стандарта на электрофореграмме испытуемого раствора (Б); |
|
B0 |
— |
отношение площади пика глутатиона к площади пика внутреннего стандарта на электрофореграмме стандартного раствора; | |
|
t1 |
— |
время миграции соответствующей примеси на электрофореграмме испытуемого раствора (Б), мин; | |
|
t0 |
— |
время миграции глутатиона на электрофореграмме стандартного раствора, мин; | |
|
|
— |
время миграции внутреннего стандарта на электрофореграмме испытуемого раствора (Б), мин; | |
|
|
— |
время миграции внутреннего стандарта на электрофореграмме стандартного раствора, мин. |
Допустимое содержание примесей:
— примеси А, В, Е – не более 0,5 % каждая;
— примесь С – не более 1,5 %;
— примесь D – не более 1,0 %;
— любая другая примесь – не более 0,2 %;
— сумма примесей – не более 2,5 %.
Не учитывают примеси, содержание каждой из которых менее 0,05 %.
Потеря в массе при высушивании. Не более 0,5 % (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.
Аммоний. Не более 0,02 %
Стандартный раствор аммония. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 74,1 мг (точная навеска) аммония хлорида, растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 10,0 мл полученного раствора. Раствор готовится непосредственно перед использованием.
Испытуемый раствор. В коническую колбу с притёртой пробкой вместимостью 25 мл помещают 50 мг субстанции, растворяют в 1 мл воды, прибавляют 0,3 г магния оксида и перемешивают.
Эталонный раствор. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 0,1 мл стандартного раствора аммония, прибавляют 1 мл воды, 0,3 г магния оксида и перемешивают.
Над реакционными смесями испытуемого и эталонного растворов подвешивают по полоске полиэтилена шириной 1 см с прикреплёнными несколькими каплями воды отрезками серебряно-марганцевой бумаги, и закрывают колбы пробками. Содержимое колб перемешивают, не допуская попадания брызг на бумагу, и выдерживают на водяной бане при температуре 40 ºС в течение 30 мин. Окраска бумаги, используемой в испытуемом растворе, не должна быть интенсивнее окраски бумаги, используемой в эталонном растворе.
Железо. Не более 0,001 % (ОФС «Железо», метод 2).
Испытуемый раствор. В делительную воронку помещают 1 г (точная навеска) субстанции, растворяют в 10 мл хлористоводородной кислоты разведённой 7,3 %, экстрагируют тремя порциями метилизобутилкетона по 10 мл, каждый раз встряхивая в течение 3 мин. Объединяют органические извлечения, прибавляют 10 мл воды и встряхивают в течение 3 мин. Используют водный слой.
Сульфаты. Не более 0,03 % (ОФС «Сульфаты», метод 2).
Испытуемый раствор. Смешивают 5 мл раствора, полученного в испытании «Прозрачность раствора», и 15 мл воды.
Хлориды. Не более 0,02 % (ОФС «Хлориды»).
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 г (точная навеска) субстанции, растворяют в азотной кислоте разведённой 12,5 % и доводят объём раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 10,0 мл полученного раствора, прибавляют 10 мл водорода пероксида, нагревают на водяной бане в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры и доводят объём раствора водой до метки.
Сульфатная зола. Не более 0,1 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определение проводят методом титриметрии. (ОФС «Титриметрия (титриметрические методы анализа)»).
В коническую колбу с притёртой пробкой помещают 0,5 г (точная навеска) субстанции, 2,0 г калия йодида растворяют в 50 мл воды, охлаждают на ледяной бане, прибавляют 10,0 мл хлористоводородной кислоты 25 %, 20,0 мл йода раствора 0,05 М, закрывают колбу пробкой и выдерживают в тёмном месте в течение 15 мин, титруют натрия тиосульфата раствором 0,1 М. Индикатор прибавляют ближе к концу титрования (индикатор – 1,0 мл крахмала раствор 1 %, содержащий 0,01 % ртути(II)).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора йода 0,05 М соответствует 30,73 мг глутатиона C10H17N3O6S.
ХРАНЕНИЕ
В защищённом от света месте.