ОФС.1.5.3.0018. Стерины в маслах жирных растительных и жирах

утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377

Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.

Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Стерины в маслах жирных растительных и жирах	ОФС.1.5.3.0018
	Вводится впервые

Метод определения стеринов в маслах жирных растительных и жирах основаны на использовании газовой хроматографии (ОФС «Газовая хроматография»), после получения неомыляемых веществ.

Методика 1

Получают неомыляемые вещества масла жирного растительного или твёрдого жира и отделяют стериновую фракцию методом тонкослойной хроматографии (ОФС «Тонкослойная хроматография»), используя пластинки, покрытые слоем силикагеля толщиной от 0,2 мм до 0,5 мм.

Испытуемый раствор А. В колбу вместимостью 150 мл, помещают раствор 0,2 % бетулина в метиленхлориде в таком объёме, чтобы количество бетулина соответствовало 10 % содержания стеринов в испытуемом образце, (например, оливы европейской плодов свежих масла жирного прибавляют 500 мкл, в случае других масел жирных растительных 1500 мкл раствора бетулина). Выпаривают в токе азота до сухого остатка.

Если в фармакопейной статье определяется только содержание индивидуальных стеринов в процентах к стериновой фракции, раствор бетулина можно не прибавлять.

В колбу помещают 5 г (точная навеска) испытуемого образца, прибавляют 50 мл калия гидроксида раствора спиртового 2 М и кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 ч, при частом перемешивании. Охлаждают до температуры ниже 25 °С и количественно переносят в делительную воронку с помощью 100 мл воды. В делительную воронку прибавляют 100 мл эфира и осторожно встряхивают. Эфирные извлечения сливают и операцию повторяют ещё 2 раза порциями по 100 мл. Объединённые эфирные извлечения переносят в делительную воронку, прибавляют 40 мл воды, осторожно встряхивают в течение 3-5 минут, оставляют до полного расслоения и отбрасывают водный слой. Эфирный слой встряхивают с несколькими порциями воды, по 40 мл каждая, до тех пор, пока водный слой не перестанет давать щелочную реакцию по фенолфталеину. Эфирный слой количественно переносят в доведённую до постоянной массы колбу.

Эфир отгоняют досуха, к сухому остатку прибавляют 6 мл ацетона. В токе азота аккуратно удаляют ацетон. Остаток в колбе сушат до постоянной массы при температуре 100 – 105 °С, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Сухой остаток растворяют в минимальном объёме метиленхлорида. Упаривают содержимое в токе азота до объёма 1 мл. В зависимости от неомыляемого содержимого испытуемого образца, обеспечивают конечную концентрацию раствора  2,5–5 %.

Испытуемый раствор Б. В колбу вместимостью 150 мл помещают 5 г (точная навеска) рапса семян масла жирного и далее поступают так, как указано в методике приготовления испытуемого раствора А, начиная со слов «…прибавляют 50 мл калия гидроксида раствора спиртового 2 М….».

Испытуемый раствор В. В колбу вместимостью 150 мл помещают 5 г (точная навеска) подсолнечника однолетнего семян масла жирного и далее поступают так, как указано в методике приготовления испытуемого раствора А, начиная со слов «…прибавляют 50 мл калия гидроксида раствора спиртового 2 М….».

Раствор сравнения. Растворяют 25 мг холестерина и 10 мг бетулина в 1,0 мл метиленхлорида.

На пластинки (для каждого испытуемого раствора используют отдельную пластинку): в виде полосы длиной 10 мм – наносят 10 мкл раствора сравнения, в виде полосы длиной 150 мм – 0,5 мл испытуемого раствора А, Б или В, соответственно. Пластинки с нанесёнными пробами сушат при комнатной температуре, помещают в камеру со смесью растворителей гексан – эфир (65:35) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдёт около 80 — 90 % длины пластинки от линии старта, её вынимают из камеры, сушат в токе азота, обрабатывают дихлорфлуоресцеина раствором 0,2 % в этаноле и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора сравнения должны обнаруживаться две зоны адсорбции: зона адсорбции холестерина и под ней зона адсорбции бетулина.

Результат. На хроматограммах испытуемых растворов А, Б, В должны обнаруживаться зоны адсорбции с близкими значениями R_f зон адсорбции соответствующим стеринам.

С хроматограммы каждого испытуемого раствора снимают силикагель зоны адсорбции стеринов, а также дополнительно зоны на 2 – 3 мм выше и ниже видимых зон адсорбции на хроматограмме раствора сравнения и помещают раздельно в три колбы вместимостью 50 мл каждая.

В каждую колбу прибавляют по 15 мл метиленхлорида и нагревают с обратным холодильником в течение 15 мин, постоянно перемешивая. Растворы фильтруют через стеклянный фильтр или соответствующую фильтровальную бумагу и промывают фильтры тремя порциями метиленхлорида по 15 мл каждая. Каждый из трёх объединённых фильтратов со смывами помещают в колбу, упаривают в токе азота до объёма 5 — 10 мл. Растворы переносят в небольшие пробирки и выпаривают в токе азота досуха.

Испытуемый раствор. К сухому остатку, полученному из испытуемого образца методом тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь из 0,04 мл хлортриметилсилана, 0,1 мл гексаметилдисилазана и 0,5 мл пиридина безводного. Смесь отстаивают в течение 5 мин и используют жидкую фазу.

Раствор сравнения А. К 9 частям стеринов, выделенных из рапса семян масла жирного методом тонкослойной хроматографии, прибавляют 1 часть холестерина. К полученной смеси прибавляют свежеприготовленную смесь из 0,04 мл хлортриметилсилана, 0,1 мл гексаметилдисалазана и 0,5 мл пиридина безводного, отстаивают в течение 5 мин и используют надосадочную жидкость.

Раствор сравнения Б. К стеринам, выделенным из подсолнечника однолетнего семян масла жирного методом тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь из 0,04 мл хлортриметилсилана, 0,1 мл гексаметилдисалазана и 0,5 мл пиридина безводного. Смесь отстаивают в течение 5 мин и используют надосадочную жидкость.

Все растворы используются свежеприготовленные.

Условия хроматографирования

Колонка	Кварцевая капиллярная 20-30 м × 0,25 — 0,32 мм, поли[метил(95)фенил(5)]силоксан или поли(цианопропил)(7)(фенил)(7)метил(8)силоксан, 0,25 мкм
Детектор	пламенно-ионизационный
Газ-носитель	Гелий, водород для хроматографии
Деление потока	1:50 или 1:100
Скорость потока, см/с	30 — 50 см/с (водород) или 20 – 35 см/с (гелий)
Объём пробы, мкл	1
Температура	Колонка	260 °С
	Инжектор	280 °С
	Детектор	290 °С

Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей холестерина, брассикастерина, кампестерина и β-ситостерина используют хроматограмму раствора сравнения А. Для идентификации пиков примесей

кампестерина, стигмастерина, β-ситостерина и ∆7-сигмастенола (∆7-стигмастерина) используют хроматограмму раствора сравнения Б.

Относительные времена удерживания стеринов (по отношению к β-ситостерину) приведены в табл. 1.

Таблица 1 – Относительные времена удерживания стеринов (по отношению к β-ситостерину) для двух различных колонок

*Пик внутреннего стандарта (бетулин) должен быть чётко отделён от пиков определяемых стеринов; площадь пика внутреннего стандарта при расчётах не учитывают.

Содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого образца в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где		–	площадь пика, соответствующего определяемому стерину;
		–	сумма площадей всех пиков, соответствующих компонентам, указанным в таблице 1; не учитывают пик бетулина.

Содержание каждого стерина в мг на 100 г испытуемого образца (Х) вычисляют по формуле:

где		–	площадь пика, соответствующего определяемому стерину;
		–	площадь пика внутреннего стандарта бетулина;
		–	навеска внутреннего стандарта бетулина, мг;
		–	навеска испытуемого образца, мг.

Методика 2

Неомыляемые вещества получают в соответствии с ОФС «Масла жирные растительные». Одновременно, в таких же условиях, получают и неомыляемые вещества из подсолнечника однолетнего семян масла жирного

и отделяют стериновую фракцию методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Испытуемый раствор. В пробирку вместимостью 15 мл с помощью трех порций (каждое по 4 мл) растворителя, использованного при получении неомыляемых веществ (обычно: эфир или петролейный эфир) переносят неомыляемые вещества. Выпаривают в токе азота досуха. Сухой остаток растворяют в достаточном объёме подвижной фазы для получения раствора с концентрацией около 4 %. Для улучшения растворимости добавляют несколько капель 2-пропанола и фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм).

Раствор сравнения. Готовят, как описано для испытуемого раствора с использованием неомыляемых веществ, полученных из подсолнечника однолетнего семян масла жирного.

Условия хроматографирования

Предколонка	5 мм × 4,6 мм, силикагель для хроматографии , 5 мкм, размер пор 6 нм
Колонка	250 мм × 4,6 мм, силикагель для хроматографии , 5 мкм, размер пор 6 нм
Подвижная фаза	гексан — 2-пропанол (1 : 99)
Скорость потока, мл/мин	1
Температура колонки, °С	25
Детектор	спектрофотометрический
Длина волны, нм	210
Объем пробы, мкл	50

Идентификация стеринов. Стериновая фракция элюируется в конце хроматограммы. Устанавливают расположение собираемой фракции по хроматограмме раствора сравнения, на которой наблюдается два основных пика, элюирующихся между 23-й и 32-й минутами. Собирают фракцию на выходе из детектора в пробирку вместимостью 15 мл с завинчивающейся крышкой и выпаривают растворитель в потоке азота.

Определение проводят методом ГХ (ОФС «Газовая хроматография»).

Испытуемый раствор. Остаток стериновой фракции, полученный методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше для испытуемого раствора, растворяют в 0,2 мл пиридина безводного и 0,2 мл смеси N,О‑бис(Триметилсилил) трифторацетамид – хлортриметилсилан (99:1). Плотно закрывают пробирку и нагревают при 80 °С в течение 20 мин, выдерживают до охлаждения и используют жидкую фазу.

Раствор сравнения. Остаток стериновой фракции, полученный методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше для раствора сравнения, растворяют в 0,2 мл пиридина безводного и 0,2 мл смеси N,О‑бис(Триметилсилил) трифторацетамид — хлортриметилсилан (99:1). Плотно закрывают пробирку и нагревают при 80 °С в течение 20 мин, выдерживают до охлаждения и используют надосадочную жидкость.

Условия хроматографирования
Колонка	Кварцевая капиллярная 30 м × 0,25 мм, поли[метил(95)фенил(5)]силоксан, 0,25 мкм
Детектор	пламенно-ионизационный
Газ-носитель	Гелий для хроматографии
Деление потока	1:25
Скорость потока, мл/мин	2,6
Объём пробы, мкл	1-3
Температура	Колонка	Время (мин)	Температура ºС
		0–38	260
		38–44	260 → 290
		44–49	290
	Инжектор		290 °С
	Детектор		290 °С

Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей кампестерина, стигмастерина, β-ситостерина и ∆7-сигмастенола используют хроматограмму раствора сравнения. Идентифицируют пики стеринов на хроматограмме испытуемого раствора с использованием хроматограммы раствора сравнения и относительных времён удерживания компонентов по отношению к β‑ситостерину (основной пик), приведённых в таблице 1.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора сравнения разрешение (R_S) между пиками кампестерина и стигмастерина должно быть не менее 4,0.

Содержание каждого определяемого стерина в стериновой фракции испытуемого образца в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где		–	площадь пика, соответствующего определяемому стерину
		–	сумма площадей всех пиков (за исключением бетулина), соответствующих компонентам, указанным в таблице 1.