ОФС.1.5.3.0017. Определение состава жирных кислот в маслах жирных растительных и жирах

утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 г. N 377

Дата введения в действие: c 01.09.2023 г.

Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания

 

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение состава жирных кислот в маслах жирных растительных и жирах	ОФС.1.5.3.0017
	Вводится впервые

Метод определения состава жирных кислот в маслах жирных растительных и жирах проводят методом газовой  хроматографии (ОФС «Газовая хроматография»).

Методика 1

Методика  неприменима  для масел, содержащих  глицериды  жирных

кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми или циклопропениловыми группами, а также для масел, в составе которых большая часть жирных кислот имеет длину цепи менее восьми атомов углерода, или для масел с кислотным числом более 2,0.

Метиловые эфиры жирных кислот могут быть получены следующими способами, если в фармакопейной статье не приведены иные условия:

1. В колбу вместимостью 50 мл помещают 0,1 – 0,15 мл тщательно перемешенного испытуемого образца, добавляют 1 мл метанола и 0,05 – 0,1 мл ацетилхлорида. Смесь аккуратно перемешивают и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Избыток метанола отгоняют. К остатку прибавляют 0,2 мл гексана (гептана или другого растворителя с соответствующей полярностью) и перемешивают.

2. В колбу вместимостью 50 мл, снабжённую пришлифованным обратным холодильником, помещают 0,1 г тщательно перемешенного испытуемого образца, приливают 10 мл метанола. К полученной смеси прибавляют 0,28 г калия гидроксида и нагревают с обратным холодильником на песчаной бане при температуре 105-110 ºС в течение 1 часа. Смесь охлаждают до комнатной температуры, приливают по каплям 0,5 мл диметилсульфата, нагревают с обратным холодильником на песчаной бане при температуре 105-110 ºС в течение 30 мин и приливают ещё 0,2 мл диметилсульфата. Из полученного раствора отгоняют метанол до объёма 2,5 мл. Смесь охлаждают до комнатной температуры, приливают 20 мл воды, переносят в делительную воронку, добавляют 20 мл гексана (гептана или другого растворителя с соответствующей полярностью) и интенсивно встряхивают. Верхний слой отделяют и фильтруют через беззольный фильтр, содержащий 1 г натрия сульфата безводного.

Раствор сравнения А. Готовят 0,5 г смеси веществ, применяемых для калибровки (калибровочной смеси), состава приведённого в таблицах 1, 2 или 3, в соответствии с указаниями в фармакопейной статье. Если в фармакопейной статье не указан определённый раствор, готовят смесь состава, приведённого в таблице 1. Смесь растворяют в гексане (гептане или другом растворителе с соответствующей полярностью) и доводят объём раствора тем же растворителем до 50 мл.

Раствор сравнения Б. Доводят 1,0 мл раствора сравнения A гептаном до 10 мл.

Раствор сравнения В. Готовят 0,5 г смеси метиловых эфиров жирных кислот, которые по составу соответствуют смеси жирных кислот, указанных в фармакопейной статье на испытуемое вещество. Смесь растворяют в гексане (гептане или другом растворителе с соответствующей полярностью) и доводят объём раствора тем же растворителем до 50 мл. Допускается также использование готовых смесей метиловых эфиров жирных кислот.

Условия хроматографирования
Колонка	Кварцевая капиллярная длиной 10-30, диаметром от 0,2 до 0,8 мм, с неподвижной фазой полиэтиленгликоль 20 М (макрогол 20000), толщиной от 0,1 до 0,5 мкм или другая неподвижная фаза
Детектор	пламенно-ионизационный
Газ-носитель	Гелий, водород или азот для хроматографии
Деление потока	1:100 или менее в зависимости от внутреннего диаметра применяемой колонки (например, в случае использования колонки с внутренним диаметром 0,32 мм деление потока должно составлять 1:50)
Скорость потока, мл/мин	1,3 (для колонки с внутренним диаметром 0,32 мм)
Объём пробы, мкл	1
Температура	Колонка	160-200 °С
	Инжектор	250 °С
	Детектор	250 °С

Если требуется линейный градиент температуры, температуру колонки увеличивают, например, со скоростью 3 ºС/мин от 170 до 230 ºС.

Пригодность хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если при использовании смеси веществ, используемых для калибровки, приведенных в таблице 1 или таблице 2, выполняются следующие условия:

— разрешение (R_S) между пиками метилолеата и метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения А должно быть не менее 1,8;

— отношение сигнал/шум (S/N) для пика метилмиристата на хроматограмме раствора сравнения Б должно быть не менее 5;

— эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения А должна быть не менее 30000 теоретических тарелок.

 

 

Таблица 1 – Смесь веществ, применяемых для калибровки (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и системой с делением потока)

Смесь веществ	Состав (в процентах м/м)
Метиллаурат	5
Метилмиристат	5
Метилпальмитат	10
Метилстеарат	20
Метиларахидат	40
Метилолеат	20

Таблица 2 – Смесь веществ, применяемых для калибровки (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и системой с делением потока)

Смесь веществ	Состав (в процентах м/м)
Метимиристат	5
Метилпальмитат	10
Метилстеарат	15
Метиларахидат	20
Метилолеат	20
Метилэйкозеноат	10
Метилбехенат	10
Метиллигноцерат	10

Примечание — при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь рекомендуется добавлять компонент испытуемого раствора с максимальным числом атомов углерода в цепи.

Хроматографическая система считается пригодной, если при использовании смеси веществ, применяемых для калибровки, приведённых в таблице 3 выполняются следующие условия:

— разрешение (R_S) между пиками метилкаприлата и метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения А должно быть не менее 4,0;

— отношение сигнал/шум (S/N) для пика метилкапроата на хроматограмме раствора сравнения Б должно быть не менее 5;

— эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения А должна быть не менее 15000 теоретических тарелок.

Таблица 3 – Смесь веществ, применяемых для калибровки (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и системой с делением потока)

Смесь веществ	Состав (в процентах м/м)
Метилкапроат	10
Метилкаприлат	10
Метилдеканоат	20
Метиллаурат	20
Метилмиристат	40

Примечание — при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь рекомендуется добавлять компонент испытуемого раствора с максимальным числом атомов углерода в цепи.

Следует избегать условий хроматографирования, которые могут дать неразделённые пики (наличие компонентов с небольшим различием между временами удерживания, например, линоленовая и арахидоновая кислоты).

Качественный анализ. Идентифицируют пики на хроматограмме раствора сравнения В (изотермические условия хроматографирования или линейный градиент температуры).

При использовании изотермических условий хроматографирования пики могут быть также идентифицированы построением калибровочных кривых с использованием хроматограммы раствора сравнения А и данных таблиц 1, 2 или 3.

На хроматограмме раствора сравнения А измеряют приведённое время удерживания (tʹ_R) каждого пика.

tʹ_R  – разница между временем удерживания пика растворителя и временем удерживания несорбирующегося (в условиях определения) вещества.

Строят график линейной зависимости:

Lg (tʹ_R)  = f (эквивалент числа атомов углерода в цепи).

Логарифмы tʹ_R ненасыщенных жирных кислот расположены на этой линии в точках, соответствующих не целым значениям «эквивалента числа атомов углерода в цепи». Эквивалент числа атомов углерода в цепи представляет собой длину теоретической цепи насыщенной жирной кислоты, которая должна была иметь такое же tʹ_R , как идентифицируемая жирная кислота. Например, у линолевой кислоты такое же tʹ_R , как у теоретической насыщенной жирной кислоты, имеющей 18,8 атомов углерода.

Идентификацию пиков на хроматограмме испытуемого раствора проводят по прямой линии и уменьшающимся временам удерживания.

Эквиваленты числа атомов углерода в цепи представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Эквиваленты числа атомов углерода в цепи (значения рассчитаны с использованием калибровочных кривых и приведены в качестве примера для колонки с макроголом 20 000)

Жирная кислота	Эквивалент числа атомов углерода в цепи
Капроновая кислота	6,0
Каприловая кислота	8,0
Каприновая кислота	10,0
Лауриновая кислота	12,0
Миристиновая кислота	14,0
Пальмитиновая кислота	16,0
Пальмитолеиновая кислота	16,3
Маргариновая кислота	17,0
Стеариновая кислота	18,0
Олеиновая кислота	18,3
Линолевая кислота	18,8
Гамма-линоленовая кислота	19,0
Альфа-линоленовая кислота	19,2
Арахиновая кислота	20,0
11-Эйкозеиновая кислота (гондоиновая кислота)	20,2
Арахидоновая кислота	21,2
Бегеновая кислота	22,0
Эруковая кислота	22,2
12-Оксостеариновая кислота	22,7
Рицинолевая кислота	23,9
12-Гидроксистеариновая кислота	23,9
Лигноцериновая кислота	24,0
Нервоновая кислота	24,2

Количественный анализ. Используют метод внутренней нормализации. Не учитывают пики, площадь которых составляет менее 0,05 % от суммы площадей всех пиков.

В определённых случаях, например, при наличии жирных кислот с 12 или менее атомами углерода, в фармакопейной статье должен быть указан поправочный коэффициент для преобразования площадей пиков в проценты (м/м).

Содержание олеиновой кислоты представляет собой сумму олеиновой кислоты (18:1 n-9) и цис-вакциновой кислоты (18:1 n-7).

Методика 2

Методика  неприменима  для  масел, содержащих  глицериды жирных

кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами или для масел с кислотным числом более 2,0.

Испытуемый раствор. В центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой помещают 0,1 г (точная навеска) испытуемого образца, растворяют в смеси 1 мл гептана (гексана или другом растворителе с соответствующей полярностью) с 1 мл диметилкарбоната, энергично перемешивают и нагревают до температуры 50±5 ºС. Прибавляют к ещё тёплому раствору 1 мл натрия раствора 1,2 % в метаноле и энергично перемешивают в течение 5 мин, прибавляют 3 мл воды и энергично перемешивают в течение 30  с. Смесь центрифугируют 15 мин со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого раствора.

Растворы сравнения и анализ данных. Если в фармакопейной статье нет других указаний, поступают, как указано в методике 1.

Условия хроматографирования
Колонка	Кварцевая капиллярная 30 м × 0,25 мм, макрогол 20000, 025 мкм
Детектор	пламенно-ионизационный
Газ-носитель	гелий для хроматографии
Деление потока	1:100
Скорость потока, мл/мин	0,9
Объём пробы, мкл	1
Температура	Колонка	0–15 мин	100
		15–36 мин	100 → 225 °С
		36–61 мин	225 °С
	Инжектор		250 °С
	Детектор		250 °С

Методика 3

Методика неприменима  для  масел, содержащих  глицериды  жирных

кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, альдегидными, кетоновыми, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами и сопряженными полиненасыщенными и ацетиленовыми соединениями из-за частичного или полного разрушения этих групп.

Испытуемый раствор. В коническую колбу вместимостью 25 мл помещают 0,1 г испытуемого образца, растворяют в 2 мл натрия гидроксида раствора в метаноле 2 % и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. Прибавляют через холодильник 2,0 мл бора фторида в метаноле 14 % и кипятят в течение 30 мин, прибавляют через холодильник 4,0 мл гептана и кипятят в течение 5 мин. Смесь охлаждают, прибавляют 10,0 мл натрия хлорида насыщенного раствора, встряхивают в течение 15 с и прибавляют такое количество натрия хлорида насыщенного раствора, чтобы верхний слой поднялся к горлу колбы. Отбирают 2,0 мл верхнего слоя, помещают в делительную воронку, промывают тремя порциями воды, по 2 мл каждая, и сушат полученный экстракт над натрия сульфатом безводным.

Растворы сравнения, хроматографическая методика и анализ данных. Если в фармакопейной статье нет других указаний, поступают, как указано в методике 1.